Introducción

El surel (Trachurus lathami) es un pez pelágico-costero que se distribuye en el océano Atlántico Occidental, desde el Golfo de Maine en los Estados Unidos (43°N) hasta el golfo de San Matías (47°S) en Argentina. El surel es capturado incidentalmente en la pesquería de caballa y es descartado por la flota comercial. En los últimos años, se han desarrollado diversas investigaciones para rentabilizar los descartes pesqueros y obtener productos de alto valor añadido. Entre los principales procesos productivos evaluados se encuentra la elaboración de conservas, generándose una gran cantidad de subproductos o residuos (cabezas y vísceras principalmente) que constituyen una fuente importante de biocompuestos de interés comercial.

Tradicionalmente estos residuos se destinan a la elaboración de harina y aceite de pescado. Sin embargo, la producción de harina necesita un suministro regular de grandes volúmenes de materia prima y su elaboración implica el uso de temperaturas elevadas que generan reacciones químicas que reducen la digestibilidad de las proteínas, la biodisponibilidad de aminoácidos y ácidos grasos esenciales (Massa et al., 2016).

En este sentido, diversas investigaciones han focalizado en el aprovechamiento de los desechos pesqueros mediante métodos no agresivos que permitan revalorizarlos, elaborando productos que mantengan sus propiedades nutritivas. Una de las alternativas altamente valoradas es la hidrólisis enzimática, mediante la cual enzimas proteolíticas exógenas digieren las proteínas presentes en los residuos pesqueros obteniendo una fracción soluble denominada hidrolizado proteico de pescado FPH, por sus siglas en inglés (Kechaou et al., 2009) y una fracción lipídica. La fracción proteica que se recupera está constituida por péptidos de bajo peso molecular, que pueden ser utilizados en distintos sectores industriales. Se han identificado una amplia variedad de péptidos presentes en los FPH de pescado con potencial nutracéutico por su contribución beneficiosa para la salud, debido a que pueden presentar capacidad antioxidante y modulante de la tensión arterial (inhibidores de la enzima convertidora de angiotensina, ACE) (Guerard, 2006; Laroque et al., 2008). En la industria alimentaria, los FPH han mostrado desempeñar una gran variedad de funciones, como sustitutos de la leche, suplementos proteicos, o como estabilizadores en bebidas y potenciadores del sabor en productos de confitería (Foh et al., 2012). También han sido estudiados como aditivos alimentarios por su solubilidad ya que mejoran propiedades como la emulsificación y gelación (Kristinsson & Rasco, 2000). Una línea de investigación incipiente, se enfoca en el uso de FPH como fuente de nitrógeno para cultivo de microorganismos (Ghaly et al., 2013).

El aceite de pescado es un producto industrial de gran valor nutricional, debido a su contenido en ácidos grasos poliinsaturados Omega-3 de cadena larga (PUFA n-3), principalmente el ácido eicosapentaenoico (EPA) y el ácido docosahexaenoico (DHA) (Valenzuela et al., 2012; Bonilla-Méndez & Hoyos-Concha, 2018). Estos ácidos grasos son altamente valorados por sus propiedades benéficas y terapéuticas en el campo nutricional y de la salud humana (Fournier et al., 2007; Zhong et al., 2007). Convencionalmente la extracción de aceite es por cocción, proceso que requiere condiciones drásticas de temperatura y presión para la coagulación de proteínas y la subsecuente liberación de aceite. Estas condiciones pueden generar reacciones de degradación que modifican parcialmente los ácidos grasos poliinsaturados presentes en la fase lipídica (Linder et al., 2005; Mbatia et al., 2010). Otro método utilizado es la extracción por solventes, que generalmente se aplica para propósitos analíticos, pero no para producción industrial, ya que utiliza sustancias con restricciones para la industria alimentaria (Rubio-Rodríguez et al., 2012), es destructiva, implica un alto consumo de tiempo y genera grandes cantidades de solvente residual (Adeoti & Hawboldt 2014). La hidrolisis enzimática constituye una alternativa tecnológicamente viable para recuperar los ácidos grasos poliinsaturados debido a las suaves condiciones de reacción (Głowacz-Rozynska et al., 2016, Lamas & Massa, 2019).

El objetivo del presente trabajo fue valorizar residuos de surel Trachurus lathami constituidos principalmente por cabezas y vísceras. Se estudió la composición proximal de la fase acuosa proteica obtenida mediante hidrólisis enzimática y la extracción de aceite de pescado, su rendimiento, caracterización fisicoquímica y el contenido de ácidos grasos.

Materiales y métodos

Las muestras biológicas utilizadas en el presente trabajo constaron de cabezas y vísceras de tres lotes de surel (Trachurus lathami). Estas muestras fueron obtenidas de campañas de investigación realizadas por el Instituto Nacional de Investigación y Desarrollo Pesquero durante el año 2019, en el área de distribución del efectivo bonaerense de la especie (34º-42ºS; 62º-52ºW), desde la costa hasta los 100 m de profundidad. Las muestras fueron separadas en lotes de 15 ejemplares, pesadas, medidas, descabezadas y evisceradas. Luego se acondicionaron en bolsas de polietileno y se congelaron a -80 °C, hasta su uso.

Para caracterizar los residuos de surel se analizó su composición proximal. Las proteínas se determinaron por el método Kjeldahl, de la Association of Official Analytical Chemists & Helrich AOAC 240.27, 1990). Para la transformación del nitrógeno en proteína bruta se utilizó el factor AOAC conversión N*6,25. La humedad se cuantificó mediante desecación en estufa a temperatura de 105ºC hasta peso constante (AOAC 952.08, 1990). Las cenizas se determinaron por calcinación en mufla a 550 ºC de temperatura, hasta la obtención de cenizas blancas y peso constante (AOAC 938.08, 1990). Los lípidos fueron extraídos y cuantificados por el método de Bligh & Dyer, (1959). Para determinar nitrógeno básico volátil total (NBVT) se usó la norma de la Comisión de las Comunidades Europeas (CEE) 149 (1995) y el ensayo de sustancias reactivas al ácido tiobarbitúrico (TBARS) fue realizado de acuerdo a Tironi (2005).

La reacción de hidrólisis se realizó utilizando 2 enzimas: la enzima Alcalase® 2.4L una endopeptidasa de Bacillus licheniformis de grado alimenticio. Además, se trabajó con la enzima Purazyme AS 60L (alkaline serine proteasa, de Bacillus licherniformis), producto considerado GRAS (Generally Recognized as Safe) para la modificación de proteínas y producción de alimentos para mascotas, entre otras aplicaciones.

La hidrólisis se realizó en un reactor termostatizado con agitación constante. Se mezclaron partes iguales del homogenato (aproximadamente 50 g) y agua destilada a 50 ºC. La mezcla se estabilizó en las condiciones óptimas de las enzimas utilizadas (pH 8.0 ± 0.3 y temperatura en 55 ± 2,5 oC). El proceso se inició con el agregado de la proteasa (relación enzima/materia prima 2 %), siendo el pH controlado con la adición de NaOH 1 M. La reacción tuvo una duración de 1 h y posteriormente la temperatura se aumentó a 85 °C durante 10 min para inactivar la enzima. El hidrolizado se centrifugó a 20,000 g (RCF) durante 30 min a 4 °C. Finalmente, los tubos se colocaron verticalmente en congelador (a -18 °C) y todas las fracciones: fase oleosa y acuosa proteica y fase insoluble (lodos) fueron separadas cortando el contenido congelado de los tubos.

La determinación del grado de hidrólisis (GH) se realizó mediante el método pH-Stat, basado en el volumen básico consumido para mantener el pH de la reacción constante, usando la siguiente ecuación (Adler-Nissen, 1986): GH (%) = (B ∙ N ∙ 100) / (α ∙ Mp ∙ htot)

Dónde B es el consumo básico en mL, N: la normalidad de la base α: grado medio de disociación de los grupos -NH o –COOH [α = (10pH – pK) / (1+ 10pH – pK), donde pK = 7.8 + (298 – T) / (298 ∙ T) ∙ 2,400 (T: temperatura en Kelvin)]; MP: masa de proteína en gramos (%N x 6.25); y htot: número total de enlaces peptídicos en el sustrato.

A fin de evaluar el proceso, uno de los parámetros determinados fue el rendimiento de la reacción enzimática en términos de extracción de aceite. El mismo se expresó como el porcentaje del aceite crudo extraído enzimáticamente (WOEM) en relación con el contenido de aceite en los residuos obtenidos por el método de Bligh & Dyer (WOBD).

Rendimiento % = (WOEM / WOBD) * 100

El aceite obtenido fue sometido a la determinación de los índices físicos: humedad y contenido de material volátil mediante el método de la estufa de vacío de la American Oil Chemists' Society (AOCS) & Firestone Ja 2a-46 (2009), densidad relativa determinada utilizando un picnómetro calibrado a 20 ºC, y color medido en escala de color Gardner (Gardner-Delta Color Comparator Pacific Scientific Bethesda, Maryland, USA). El comparador consta de un arreglo de dos ruedas en las están incrustadas nueve filtros de vidrio óptico de color. Los filtros van desde el agua blanca hasta el ámbar profundo. Se coloca un tubo con la muestra de aceite entre las dos ruedas de filtro y se giran las mismas hasta que el filtro de vidrio más cercano en color al aceite esté en su lugar, arrojando la notación que describe el parámetro (AOCS Td 1a-64, 2009).

Para caracterizar nutricionalmente los aceites obtenidos, se determinó el perfil de ácidos grasos. Una alícuota de cada muestra de aceite fue pesada a la milésima parte, y posteriormente, se realizó una metilación según la norma de la International Organization for Standardization (ISO) (2011). El aceite fue disuelto con isooctano hasta una concentración de 1 mg/mL en un tubo de vidrio, seguidamente se le adicionaron 0.5 mL de KOH/MeOH (2 mol/L). La mezcla fue agitada con vortex durante 1 min y se le agregó NaCl (solución saturada al 40 %) en igual volumen que el isooctano. Esta solución se agitó nuevamente por 10 s y la fase superior se transfirió a un tubo limpio. Los ésteres metílicos de los ácidos grasos (FAME, del inglés Fatty Acid Methyl Esters) fueron separados e identificados en un cromatógrafo gaseoso Shimadzu® GC-2010, equipado con un inyector split (Tº = 250 ºC; tasa de split = 5.0), una columna capilar de sílica fundida Omegawax Supelco® 320 (30 m de longitud, 0.32 mm de diámetro interno, 0.25 μm de espesor del film de la fase estacionaria) y un detector de ionización a la llama (FID, del inglés Flame Ionization Detector, Tº = 260 ºC). El programa de temperatura utilizado en la columna comenzó con un valor de 50 ºC, seguido de un incremento de 55 ºC/min hasta 200 ºC, sosteniendo esta última temperatura durante 14 min, siendo helio el gas portador empleado. La corrida cromatográfica tuvo una duración total de 40 min. Para identificar los ácidos grasos, se emplearon estándares comerciales de ácidos grasos de organismos marinos (Supelco® FAME Mix C4-C24 + PUFA No 1 Marine Source) cuyos tiempos de retención fueron utilizados para compararlos con los ácidos grasos presentes en la muestra. Los cromatogramas resultantes de cada corrida se analizaron con el software GCsolution (Shimadzu®).

En las determinaciones realizadas por duplicado se informan los dos valores obtenidos.

Resultados

Características físicas y químicas de los residuos de surel

En la tabla 1 se presenta la caracterización de los residuos de surel, donde se observa que aproximadamente el 70 % fue agua y el 30 % representó materia seca. El mayor componente de interés nutricional fue la proteína cruda seguida del contenido graso y ceniza total. La determinación de bases volátiles totales utilizada como medida para evaluar la calidad de los productos pesqueros, arrojó valores cercanos a 25 mg/100 g de producto. Este término general que incluye la medición de algunos compuestos básicos volátiles como la trimetilamina, dimetilamina, amoniaco y otros compuestos nitrogenados da una idea de la frescura de la materia prima, ya que los mismos se generan como consecuencia de los procesos de deterioro (Márquez Figueroa et al., 2006). Otro análisis de calidad nutricional realizado fue TBARS, que cuantifica el malonaldehído (MDA), uno de los principales productos formados durante el proceso oxidativo. Los valores de TBARS obtenidos oscilaron entre 0.9 y 1.29 mg MDA/kg de pescado.

Tabla 1.

Composición proximal de cada lote de residuos analizados.

*Datos propios obtenidos del análisis proximal de residuos de surel. Los ejemplares de surel fueron capturados durante una campaña de investigación del Instituto Nacional de Investigación y Desarrollo Pesquero (INIDEP) realizada en 2019.

Caracterización del hidrolizado proteico

En la tabla 2 se presentan los resultados de la composición proximal de los hidrolizados obtenidos y la muestra control expresados en base a materia seca. El contenido de ceniza disminuyó casi a la mitad en los hidrolizados respecto del control, siendo mayor en el hidrolizado obtenido con Purazyme AS 60L. La proteína cruda alcanzó desde aproximadamente el 55 % en el control hasta alrededor del 73 % en ambos hidrolizados, mientras que el contenido graso descendió significativamente después del tratamiento con ambas enzimas.

Tabla 2.

Composición proximal de los hidrolizados proteicos de Tracchurus lathami.

Rendimiento y caracterización del aceite extraído

En la tabla 3 se puede observar que el rendimiento fue mayor con Purazyme AS 60L. Ambas enzimas lograron extraer porcentajes mayores al 50 % respecto de los lípidos totales presentes.

Tabla 3.

Rendimiento del aceite extraído.

Los valores de humedad y contenido de material volátil, fueron menores al 1 % en ambos aceites. La densidad relativa fue ligeramente alta, siendo 0.991 g/mL y 0.997 g/mL para los aceites obtenidos con Alcalase® 2.4L y Purazyme AS 60L, probablemente debido al contenido de impurezas arrastradas durante la separación de fases. La escala de color Gardner presenta una serie de 18 variaciones de color que van desde casi transparente, amarillo claro (Gardner 1) a marrón oscuro (Gardner 18). Gardner 0 está definido por agua destilada limpia (Hasnul Hadi et al., 2021).

En el presente trabajo, la escala de color Gardner arrojó valores entre 7 y 8 para el aceite obtenido con Alcalase® 2.4L y entre 9 y 10 para el aceite obtenido con Purazyme AS 60L (Figura 1). Ambos aceites se visualizaron amarillentos, brillantes y transparentes.

La valoración nutricional de los aceites obtenidos fue evaluada mediante la determinación del perfil de ácidos grasos presentes. La tabla 3 muestra el perfil porcentual del contenido de ácidos grasos obtenidos por la fracción extraída mediante Bligh & Dyer a partir de la materia prima de origen, y las muestras obtenidas por extracción enzimática a partir del residuo.

Figura 1.
Muestras sometidas a la escala de color Gardner a) aceite obtenido con la enzima Purazyme AS 60L, b) aceite obtenido con Alcalase® 2.4L.

Discusión

Los macronutrientes encontrados en la materia prima arrojaron valores que resultan de interés. Tanto el contenido proteico como el lipídico indican un potencial tecnológico del residuo para la extracción de este tipo de compuestos. Los datos de NVBT se encuentran por debajo de los límites de aceptabilidad establecidos por el Código Alimentario Argentino (CAA 1969) (30 mg NBVT/100 g de pescado), y la Comisión de las Comunidades Europeas (35 mg NBVT/100 g de pescado) (CEE Reglamento (CE) Nº 1022/2008.). Respecto a los análisis de TBARS, todos los valores están por debajo de 2 mg MDA/kg, límites indicados como sensorialmente perceptibles y valor necesario para considerar la materia prima en buenas condiciones (Chow, 2007). Otros autores indican que valores superiores a 1-2 mg MDA/kg de pescado se asocian con sabor rancio y olor característico (Colla & Prentice–Hernández, 2003). Para evitar el deterioro es importante respetar el buen manejo higiénico sanitario de la materia prima, desde el momento de la captura, hasta el procesamiento de la muestra, haciendo énfasis en evitar la exposición a la luz, el calor y el oxígeno.

El proceso de hidrólisis enzimático se inicia con la formación de un complejo enzima-sustrato (proteína), seguido de la rotura del enlace amídico dando como resultado la separación de la cadena, luego se produce la separación del péptido restante de la enzima después de un ataque nucleofílico de una molécula de agua (Benítez et al., 2008). Conforme a esto, el aumento del contenido proteico después de la reacción puede atribuirse a la generación de péptidos producto de la hidrólisis, los cuales pasan a la fase acuosa que se separa de la grasa (Belén Camacho et al., 2007). El GH con la enzima Alcalase® 2.4L fue de 12.47% y con Purazyme AS 60L resultó 12.32%. Balti y colaboradores (2011), reportaron valores en el rango de 8 a 10 % de GH para hidrolizados de proteínas de sepia (Sepia officinalis) producido por Alcalase® 2.4L y proteasas de Bacillus licheniformis NH1. Del mismo modo, Bougatef y colaboradores (2008) investigaron la producción de hidrolizados de cabezas y vísceras de sardinela (Sardinella aurita) mediante tratamiento con Alcalase® 2.4L, quimotripsina y preparaciones de enzimas crudas de Bacillus licheniformis NH1 y Aspergillus clavatus ES1 logrando un GH en el rango de 4 a 10 % a los 60 min de reacción.

Además, en el presente trabajo la fase lipídica fue separada post centrifugado y congelación, por lo tanto, hay un descenso en el contenido graso como consecuencia de la acción enzimática y la posible interacción con el NaOH adicionado para ajustar el pH del medio, originando jabones que son apartados de la mezcla de reacción durante el centrifugado (Belén Camacho et al., 2007). Generalmente en la fase superior, se acumulan todas las fracciones insolubles removidas en la centrifugación. Además, la separación del contenido graso, previene la rancidez oxidativa de los hidrolizados (Kristinsson & Rasco, 2000).

Respecto del rendimiento de aceite, los resultados obtenidos son concordantes con los valores establecidos por Gbogouri y colaboradores (2006) para el aceite extraído de cabezas de salmón mediante el uso de una solución enzimática similar (Alcalase® 2.4L ®, Neutrasa® Protamex®). Rubio-Rodríguez y colaboradores (2012) reportaron rendimientos cercanos al 100% trabajando con residuo de salmón y la enzima Alcalase® 2.4L. Asimismo, Głowacz-Rozynska y colaboradores (2016) lograron extraer el 70% del aceite, utilizando proteasas en cabezas de salmón. Sin embargo, el rendimiento con Purazyme AS 60L es inferior al obtenido en la extracción de aceite de hígado de raya utilizando las mismas condiciones de hidrólisis (Lamas & Massa, 2019), probablemente debido a que los hígados de especies cartilaginosas presentan mayor contenido graso que la materia prima utilizada en este estudio.

Tanto la densidad como el contenido de material volátil, arrojaron valores esperables para aceites crudos de este tipo. El color de los aceites es un factor determinante en la calidad. Por lo general, se expresa según el tono, que reconoce el color del aceite; el croma, que muestra qué tan cerca está el color de un tono puro y la luminosidad representa la comparación del color como claro u oscuro (Hasnul Hadi et al., 2021). Los aceites oscuros requieren un procesamiento de alto costo para lograr un producto claro y aceptable (Lamas & Massa, 2019). En general, en el proceso de refinado diversas sustancias indeseables como fosfolípidos, ceras, humedad residual, aldehídos, cetonas y pigmentos son fácilmente removidas (Lamas & Massa, 2017, 2019). En el presente trabajo, el color de ambos aceites crudos obtenidos fue amarillento, translúcido y brillante. El aceite obtenido con la enzima Purazyme AS 60L fue ligeramente más oscuro. Ambos aceites obtenidos arrojaron valores dentro de los estándares de calidad del pescado crudo aceites que indican valores máximos para la escala de Gardner de 14 (Bimbo, 1998).

Todas las muestras mostraron el mismo patrón de ácidos grasos, resultando una mayor proporción de la fracción de saturados (SFA) seguida de la fracción de poliinsaturados (PUFA) y monosaturados (MUFA). Sin embargo, para los aceites obtenidos por enzimas, la fracción de SFA no presentó diferencias significativas con los PUFA. Esto podría indicar que hay una variación en la composición porcentual de las distintas partes de los especímenes estudiados. Asimismo, la extracción de aceite de hígado de Zearaja flavirostris y Atlantoraja castelnaui utilizando las mismas enzimas mostró un perfil de ácidos grasos diferente respecto del extraído por Bligh & Dyer, destacándose los PUFA (Lamas & Massa, 2019). Probablemente esto es debido a que la extracción enzimática es una tecnología que utiliza condiciones suaves de temperatura sin el agregado de solventes químicos, lo que permite extraer los ácidos grasos con insaturaciones más fácilmente (Tabla 4).

Tabla 4.

Perfil cualitativo de ácidos grasos de Trachuruslathami.

Entre los SFA, todos los aceites mostraron predominancia del ácido palmítico, seguido del esteárico y mirístico. Esto resulta de interés, dado que los ácidos grasos palmítico y esteárico pueden ser utilizados como fuente de energía (Navarro-García et al., 2014). Dentro de los MUFA los ácidos grasos predominantes fueron el oleico y palmitoleico, lo que también constituye un hallazgo importante, ya que las dietas ricas en ácido oleico se asocian a la reducción de riesgo en el desarrollo de diabetes tipo 2, según lo investigado por Kien y colaboradores (2013).

Los aceites obtenidos con ambas enzimas mostraron un contenido de PUFA proporcionalmente mayor a la materia prima de origen siendo el EPA (20: 5 n-3) y el DHA (22: 6 n-3) los principales componentes. Existe suficiente evidencia que demuestra que el EPA y el DHA tienen eficacia antiarterosclerótica y pueden prevenir y reducir enfermedades del sistema circulatorio (Lee et al., 2008), contribuir a la prevención de la enfermedad de Alzheimer (Gu et al., 2010) y la degeneración relacionada con la edad (Hodge et al., 2006). Además, el consumo de estos ácidos grasos por parte de mujeres embarazadas contribuye al correcto desarrollo y la salud del feto y del recién nacido (Noakes et al., 2012; Palmer et al., 2012). De esta manera, el aceite de surel parece ser una buena fuente de PUFA n-3 que son reconocidos por sus beneficios para la salud.

Agradecimientos

Los autores agradecen a la Dra. Brenda Temperoni por su colaboración en la determinación de ácidos grasos.

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